ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ И СЛАБОГО ОСНОВАНИЯ НА ПРОФИЛЬ ГРАДИЕНТА рН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ

УДК 541.544:681.3
ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ И СЛАБОГО ОСНОВАНИЯ НА ПРОФИЛЬ ГРАДИЕНТА рН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОВЕРКА
А.Б.Тессман, А.В.Иванов, М.С.Вакштейн
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Химический факультет; 119899, Москва, ГСП-3, Ленинские горы
Поступила в редакцию
Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено влияние состава стартового раствора и элюента на образование участков увеличения рН на профиле нисходящего градиента рН. Предложены уравнения для расчета степени протонирования анионообменного сорбента в зависимости от параметров системы. Рассмотрено совместное влияние ионной силы подвижных фаз и присутствия слабого основания в элюенте на профиль градиента рН. Правильный выбор ионной силы стартового раствора и элюента (Iср > Iэ.) позволяет получать практически линейные градиенты в диапазоне до 2 ед. рН при использовании элюента простейшего состава.

Формирование внутреннего градиента рН в хроматофокусировании заключается в предварительном уравновешивании анионообменной хроматографической колонки стартовым раствором (СР) с высоким значением рН, содержащим слабое основание, и в последующем пропускании элюента с более низким рН, составленного из слабых органических кислот или амфолитов [1]. Параметры подвижной фазы, влияющие на профиль внутреннего градиента рН, можно разделить на две группы: оказывающие сильное влияние - природа и концентрация кислоты в элюенте, и параметры, действие которых носит сложный, неявный характер. К таким параметрам можно отнести ионную силу СР и элюента, и наличие в элюенте "неудерживаемого" слабого основания (которое обычно используют для подведения рН элюента). Влияние природы и концентрации кислоты подробно рассмотрено нами ранее [2-4]. Отдельные случаи, связанные с влиянием ионной силы и слабого основания элюента мы впервые рассматривали в [3, 5]. Однако детальное рассмотрение их влияния потребовало развития теоретических принципов формирования градиентов рН и проведения дополнительных экспериментов, подтверждающих высказанные ранее предположения [6]. Очевидно, что наиболее сильно влияние параметров проявится в системах, содержащих небольшое количество компонентов - 1-2 слабых кислоты, формирующих градиент рН. Данная статья посвящена изучению совместного влияния ионной силы и наличия слабого основания в элюенте.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура и реагенты. Использовали хроматографическую систему, состоящую из изократического насоса высокого давления “Beckman-114М” (США) или "Altex-110A" (США), хроматографической колонки из нержавеющей стали (250х4,6 мм), заполненной сорбентом Tetren-SiO2 (7,5 мкм) на основе кремнезема Силасорб Si-600 с привитыми группами тетраэтиленпентамина [7], самодельной проточной ячейки для измерения рН [8], цифрового рН-метра “TOA Electronics-HM-20S" (Япония) с комбинированным электродом GST-5211C, перистальтического насоса низкого давления "Varioperpex-2120" ("LKB-Bromma", Швеция) и самописца “LKB-Bromma” (Швеция).
В качестве стартовых растворов использовали 25 мМ растворы Трис-HCl или Трис-H2C2O4 (рН 7,5, в отдельном эксперименте – 6,1); в качестве элюентов – 2-20мМ растворы щавелевой кислоты; в ряде экспериментов значение рН элюента (рН 3,5-3,8) регулировали добавлением рассчитанного по программе "Acid-Base Calculator" [9] количества 50 мМ раствора Трис. Ионную силу СР и элюента создавали добавлением рассчитанного количества 4 М раствора NaCl. Все растворы готовили из препаратов фирмы “Merck” (Германия) квалификации “ч.д.а.”. Для расчета степени протонирования сорбента использовали специально написанное MS Excel-приложение "Alpha" с элементами VBA.
Методика эксперимента. Хроматографическую колонку уравновешивали СР до значения рН, соответствующего начальной точке градиента, затем пропускали элюент с pH 3,5. Кислотность эффлюента контролировали в потоке и регистрировали сигнал цифрового рН-метра с помощью самописца.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Теоретические принципы. Характерные участки профиля градиента рН связаны с процессами, протекающими внутри анионообменной колонки при пропускании СР, а затем элюента. Регистрируемым сигналом является концентрация протонов в эффлюенте, поэтому о состоянии групп сорбента можно судить только косвенно, используя модельные представления. Сорбент, например, Tetren-SiO2, содержит слабоосновные аминогруппы. СР содержит смесь слабого основания и его соли, которая получается при добавлении кислоты для подведения рН раствора. Анион кислоты в соответствии с принципами ЖМКО может быть либо жестким (в случае добавления HCl), либо мягким основанием (в случае добавления слабой органической кислоты). В первом случае реакцию протонирования аминогрупп сорбента с одновременным связыванием Cl- из стартового раствора можно описать уравнением (1) с соответствующей константой равновесия (2):
(1),
(2).
Протонированная аминогруппа сорбента – мягкая кислота, поэтому сродство аниона органической кислоты, например, оксалата, к аминогруппе будет выше, чем у Cl-. Тогда во втором случае при протонировании аминогрупп возможно образование структуры, подобной ионной паре:
(3),
(4).
Приведенные уравнения пока не содержат двух важных параметров, существенно влияющих на величину константы протонирования аминогрупп сорбента. Такими параметрами являются ионная сила подвижной фазы и степень протонирования сорбента. Учет этих параметров связан с полиэлектролитной природой сорбента. Запишем выражение для Kp' (2), включающее ионную силу и степень протонирования, при следующих допущениях:
а) равновесные концентрации протонированных аминогрупп и Cl- в фазе сорбента равны;
б) ионная сила соответствует концентрации Cl- в подвижной фазе.
Отсюда, считая, что степень протонирования () в данном случае определяется как:
(5),
где q - максимальная емкость сорбента (общее количество функциональных групп на единицу массы сорбента), получаем для Kp':
(6).
Логарифмируя, получаем выражение, связывающее константу кислотности привитых групп сорбента с рН раствора и его ионной силой, степенью протонирования (оттитрованности) и максимальной емкостью сорбента:
(7).
На практике часто встречается экспериментальные системы [4-6], включающие анионообменный сорбент Tetren-SiO2 с емкостью 0,35 ммоль/г, и СР с рН 7,5, который, кроме слабого основания (например, Трис или гексамина), может содержать сильный электролит (до 1 М NaCl). Для подведения рН используют либо сильную кислоту - HCl [1], либо слабую кислоту (например, щавелевую), входящую в состав элюента [4, 5]:
Рассчитаем степень протонирования сорбента после пропускания различных стартовых растворов. Для СР первого типа (например, Трис-HCl, отсутствие NaCl, ионная сила низка и определяется концентрацией HCl) при условии, что lgKp' для сорбента с привитыми аминогруппами типа Tetren-SiO2, по литературным данным, является фиксированной величиной, равной ~8,0 [10], степень протонирования вычисляется из квадратного уравнения (6). В случае добавления сильного электролита в стартовый раствор проявляются полиэлектролитные свойства сорбента Tetren-SiO2, следовательно, lgKp' уже нельзя считать фиксированной величиной. Ранее мы использовали функциональную зависимость lgKp' от ионной силы и степени протонирования, конкретный вид которой задавался полиномом, описывающим кривые потенциометрического титрования Tetren-SiO2, полученные при различной ионной силе [3]. В этом случае для решения уравнения (6), где lgKp'=f(I, ), необходимо использовать численные методы [11]. В таблице приведены примеры расчета степени протонирования для фиксированной и переменной величины lgKp'.
Рассмотрим теперь СР второго типа (Трис-H2C2O4), в котором для подведения рН используют слабую органическую кислоту, входящую в состав элюента. Cтепень протонирования в данном случае определяется как:
(8)
и при отсутствии NaCl в подвижной фазе рассчитывается из уравнения:
(9),
где [А-] - равновесная концентрация оксалат-иона, равная при рН 7,5 его общей концентрации, а lgKp'' является фиксированной величиной. Следует отметить, что на подобных аминосодержащих сорбентах оксалат удерживается по одной карбоксильной группе [4, 12]. Вторая карбоксильная группа может связывать любой катион, находящийся в подвижной фазе.
Величина lgKp'' из литературных данных не известна, а экспериментально получить ее из кривых потенциометрического титрования сорбента слабой щавелевой кислотой даже при высокой ионной силе практически невозможно, так как скачок на кривой титрования не будет выражен. Однако можно попытаться оценить величину lgKp'' по сравнению с lgKp', несмотря даже на различную размерность этих констант. Как уже было сказано выше, сродство оксалата к аминогруппам должно быть выше, чем у Cl-, и можно предположить, что lgKp'' будет больше, чем lgKp' и равен ~8,5-9,0. Отсюда степень протонирования сорбента, рассчитанная по уравнению (9), при пропускании СР, содержащего Трис и слабую кислоту (25 мМ Трис-10 мМ H2C2O4, рН 7,5), будет равна 9%, если lgKp''=8,5, и 24%, если lgKp''=9,0.
При добавлении сильного электролита в СР для расчета степени протонирования нужно использовать две константы протонирования - с одновременным связыванием оксалата (Kp'') и хлорида (Kp'). Считая, что lgKp' и lgKp'' - фиксированные величины, степень протонирования сорбента рассчитываем из квадратного уравнения:
(10),
где .
При высоких концентрациях NaCl в стартовом растворе, с учетом полиэлектролитных свойств сорбента Tetren-SiO2, lgKp' описываем как фунцию от I и  [3] и решаем уравнение (10) с помощью численных методов. Рассчитанные степени протонирования сорбента для данного случая при фиксированной и переменной величине lgKp' приведены в таблице.
Как видно из таблицы, для СР, подведенного сильной кислотой и содержащего сильный электролит, при очень низкой ионной силе (0,001) полиэлектролитная природа сорбента не влияет на степень протонирования, и для расчета можно использовать уравнение (6), которое в этом случае будет квадратным уравнением. С увеличением ионной силы степень протонирования, рассчитанная без учета полиэлектролитности сорбента, резко возрастает, и при I=1 составляет 91%, тогда как с учетом полиэлектролитной природы сорбента получаем только 26%. Таким образом, при высокой ионной силе (начиная с 0,1) использование фиксированной величины lgKp' приводит к завышению результатов в 3-4 раза по сравнению с истинной степенью протонирования. Поэтому для расчета степени протонирования при I  0,1 следует рассматривать lgKp' как функцию, например, от I и .
Для СР второго типа, в который для подведения рН добавляли слабую кислоту, при высокой ионной силе (выше 0,1) сохраняется тенденция к завышению степени протонирования, рассчитанной по уравнению (10) без учета полиэлектролитности сорбента, в 2-3 раза по сравнению с истинной степенью протонирования. Проявление полиэлектролитной природы сорбента обусловлено влиянием высокой ионной силы. Из таблицы видно, что при высокой ионной силе основной вклад в величину  вносит процесс протонирования сорбента с одновременным связыванием Cl- (уравнение 1). Это означает, что для расчета степени протонирования в таких системах можно использовать фиксированное значение lgKp'' (уравнение 4). Увеличение lgKp'' от 8,5 до 9,0 изменяет степень протонирования при ионной силе выше 0,1 максимум в 1,3 раза.
Экспериментальная проверка. Первый блок поставленных экспериментов был направлен на подтверждение приведенных выше теоретических положений о влиянии ионной силы подвижных фаз. Второй блок экспериментов направлен на подтверждение влияния слабого основания на профиль градиента рН, теоретически рассмотренного нами в предыдущих статьях [5, 6]. Третий блок экспериментов связан с изучением совместного влияния ионной силы и слабого основания.
Влияние ионной силы. На рис.1 (кривые 1-3) приведен ряд градиентов рН, полученных экспериментально при пропускании СР с различной ионной силой через анионообменную колонку с сорбентом Tetren-SiO2. Ионную силу СР в каждом эксперименте изменяли от 0,03 до 1 добавлением NaCl. После пропускания СР во всех случаях через колонку пропускали элюент одного и того же состава, не содержащий сильный электролит. Начальные участки кривых 1-3 представляют собой плато, совпадают по величине рН и по протяженности в объемах эффлюента, что говорит о том, что степень протонирования сорбента изменяется незначительно, несмотря на резкое различие в ионной силе СР. Это подтверждает, что в таких системах необходимо учитывать полиэлектролитную природу сорбента, а  рассчитывать по уравнению (6) с использованием переменной Kp'. Рассчитанная степень протонирования при изменении I от 0,03 до 1 изменяется от 18 до 26%. Участок градиента с плавным снижением рН от 7,5 до ~6 связан с постепенным титрованием слабоосновных групп сорбента слабой кислотой из элюента, а также с процессом ионного обмена Cl- на оксалат. Небольшое различие в протяженности этого участка градиента жестко коррелирует с небольшим различием в степени протонирования сорбента: 18-22-26% при ионной силе 0,03-0,1-1 соответственно. Дальнейшее резкое снижение рН эффлюента связано с выходом Cl- из колонки.
В случае, когда ионная сила элюента высока, и концентрация сильного электролита (NaCl) на 1-2 порядка выше, чем концентрация слабой кислоты в элюенте, на профиле градиента наблюдали увеличение рН выше рН стартового раствора (рис.1, кривая 4). Степень протонирования сорбента после пропускания СР не выше 25%, отсюда при пропускании элюента с низким рН идет допротонирование аминогрупп сорбента (уравнения 1, 3). Но, т.к. концентрация Cl- значительно выше, чем оксалат-иона, преобладает протонирование сорбента с одновременным связыванием хлорид-иона (1), из колонки выходит смесь NaCl и Na2C2O4, что приводит к увеличению рН эффлюента до 7,8, что согласуется с расчетом по программе [9].
Из рис.1 видно, что форма градиента рН связана не только с природой и концентрацией активного компонента (т.е. щавелевой кислоты), но очень сильно зависит от ионной силы СР и элюента (отличие кривых 1-3 от кривой 4). Правильный выбор ионной силы (Iср > Iэ) позволяет получить градиент с плавным, линейным участком в диапазоне от 7,5 до 6 рН, который можно использовать для разделения смеси белков или аминокислот, имеющих pI в данном диапазоне. Важно отметить, что подобный градиент рН с линейным участком удалось получить, используя элюент с единственным активным компонентом, что существенно снижает стоимость метода хроматофокусирования.
Влияние слабого основания в элюенте при Iср > Iэ. На рис.2. представлены градиенты рН, полученные при различной ионной силе СР и постоянной ионной силе элюента (при отсутствии NaCl). Для того, чтобы показать, как меняется положение и форма участка градиента, связанного с влиянием слабо